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PCR技术在微生物检测中的应用

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-10-22  浏览次数:630
 PCR即聚合酶链式反应,是一种体外扩增DNA序列的技术。现代PCR概念最早是由美国科学家Kary Mullis于20世纪80年代早期发明的,他也因此荣获了1993年的诺贝尔化学奖。如今该技术已成为生物前沿技术之一。

PCR技术的基本原理类似于细胞内DNA的复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。简单来说PCR包括变性—退火—延伸三个基本反应阶段。其基本过程为:①检测样品经预处理后获得DNA模板;②DNA模板的变性:模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离后成为单链,以便它与引物结合,为其后阶段反应做准备;③模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,这时人工合成的引物与模板DNA单链经互补序列配对结合;④引物的延伸:DNA模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的催化作用下,以4种三磷酸脱氧核苷酸为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原则,合成一条新的与模板DNA 结构组成相同的新链。重复循环变性—退火—延伸三过程,就可获得更多的新链,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,一般单一拷贝的基因循环25~30次DNA便可扩增l00万~200万倍。PCR反应产物再通过凝胶电脉和基因测序等DNA分析技术确定扩增DNA序列的具体信息。

1PCR技术在微生物检测的应用前景

依据一次性使用卫生用品卫生标准(标准号:GB 15979—2002)中的微生物指标规定,在一次性使用卫生用品中是不能有大肠杆菌以及3种致病性化脓菌(绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌)的检出。该要求是对4种菌的定性检测,标准中用到的检测方法是传统的微生物鉴定法,先通过增菌或分离培养,然后进一步根据各菌群特征做一些鉴定试验,最后综合各项结果判断。通常这种传统的检测方法时间较长,而且在菌量少的情况下易出现假阴性的结果。而在环境监测、食品检测等领域中已经应用的PCR技术则可缩短检测所消耗的时间,且敏感性更高。

1.1 大肠杆菌的检测

相关研究显示,通过大肠杆菌特异性引物(上游引物:5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’ ,下游引物:5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’)进行PCR扩增可以检出饮用水中的大肠杆菌,即使在菌量极低的情况下也可以检出。但该研究还发现对于不能够破坏微生物DNA的消毒方法会造成PCR检测的假阳性,而GB 15979—2002中对一次性使用卫生用品所使用到的消毒方法通常为环氧乙烷消毒、电离辐射消毒和压力蒸汽消毒。而这几种灭菌方法都会直接破坏微生物的核酸,因此PCR技术用于检测一次性使用卫生用品中致病菌有可行性。

1.2 绿脓杆菌的检测

相关研究表明使用绿脓杆菌外毒素A(ETA)基因作为模板来快速检测绿脓杆菌。ETA基因仅在绿脓杆菌基因组中存在,且Gray等人已经从一个过量表达ETA的绿脓杆菌菌株中克隆和测定了ETA的结构基因。因此ETA基因可以作为检出绿脓杆菌的靶基因。根据ETA基因序列设计特异性引物,通过PCR反应扩增目的基因序列,如果能够扩增出目的条带,那就能据此来确定绿脓杆菌的存在。

1.3 金黄色葡萄杆菌和溶血性链球菌的检测

PCR技术用于检测金黄色葡萄球菌的研究多数是关于食品卫生。张亚兰[8]的研究将PCR的反应做了优化,消除了一些会影响PCR反应的抑制因素,从而提高检测方法的灵敏度。同时应用PCR技术检测链球菌的研究数据显示这种方法具有可行性。

2 PCR技术在应用过程中可能存在的问题

PCR技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性。此外,与传统的微生物检测法相比PCR技术能缩短检测时间,但同时将该技术引进到卫生用品的检测也存在一些问题。首先,由于检测样品是卫生用品,在样品的预处理、样品DNA的提取等具体的操作过程中可能会遇到不同的问题;其次,尽管PCR反应的步骤很简单,但是具体的操作是复杂的,如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此不同的反应体系应该确定适当的反应条件以避免假阴性或假阳性等情况的产生。所以要引入PCR技术来检测卫生用品中的微生物,需要进行预试验,完善检测方法。
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