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提高弯曲芽孢杆菌的热稳定性

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-10-11  浏览次数:769
摘要:运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌 Bacillus flexus CCTCC 2015368 β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。

野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55 ℃,突变体D476N在55 ℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T50值比野生型提高4 ℃。

突变体D476N的Km值为97.98 µmol/L,是野生型(85.86 µmol/L) 1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01 kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。

β-淀粉酶(β-amylase,EC 3.2.1.2),又称淀粉β-1, 4-麦芽糖苷酶,是一种外切型淀粉酶,能够从淀粉的非还原末端依次水解相隔的α-1, 4-葡萄糖苷键生成麦芽糖。在大麦、甘薯、玉米、小麦和大豆等高等植物中都有着较丰富的β-淀粉酶,其在酿造行业及食品工业中有很大的应用价值。

例如,啤酒酿造行业利用麦芽中的β-淀粉酶直接糖化,白酒工业中用作糖化剂;在食品工业中主要用于生产高麦芽糖浆、麦芽糖醇和饴糖等。自1974年Higashihara等首次发现了巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium 胞外含有β-淀粉酶以来,又陆续发现其他几种能产生该酶的微生物,包括蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 、环状芽孢杆菌 Bacillus circulans 、多粘芽孢杆菌 Bacillus polymyxa 、热厌氧杆菌属 Thermoanaerobacterium 和高温放线菌 Thermeoactinomyces sp.等。

由于植物来源的β-淀粉酶提取、纯化过程较为复杂,成本较贵,相比而言微生物来源的β-淀粉酶具有生产操作简单、适合大规模工业化生产的优点。但是现已报道的微生物来源的β-淀粉酶大多耐热性差,且比酶活不高,不利于其工业化应用。因此筛选出高热稳定性的微生物β-淀粉酶对其在淀粉糖工业中的应用有着十分重要的意义。

易错PCR属于蛋白质的非理性设计,不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素,而是通过模拟自然进化机制来为酶基因创造体外进化的条件,进而对目的蛋白进行分子改造,并定向筛选研究进化酶的酶学性质。易错PCR技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一,具有操作方便、快速、高效的优点。

目前国内外多数专家学者使用体外分子进化技术研究了多种酶制剂,诸如脂肪酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等,其酶学性质都得到了一定的改善。对于微生物来源β-淀粉酶的研究,目前主要是围绕不同宿主的克隆表达、酶学定性,而针对其酶学性质的分子改造显得较少,在定向进化提高其热稳定性方面,尚未见相关文献报道。
 
β-淀粉酶作为一种重要的工业用酶,广泛应用于淀粉糖、食品及医药等生产领域。例如,与麦芽糖淀粉酶、普鲁兰酶等复配制备超高纯度麦芽糖浆,生产高附加值的海藻糖、麦芽酮糖等。然而其热稳定性差,不利于酶的复配转化,具有容易染菌、反应液粘度高等缺点。本研究通过易错PCR技术对比酶活较高的弯曲芽孢杆菌来源的β-淀粉酶进行体外分子定向进化,通过LB琼脂淀粉板初筛、96孔板DNS法测酶活等方法,高通量筛选热稳定性提高的突变体,以期为其工业化生产奠定基础。 
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