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研究芽孢杆菌对梨灰霉和青霉病菌的材料与方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-10-11  浏览次数:501
1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验果: 试验用‘黄冠梨’于2016年8月中旬采自河北省晋州市,选择大小一致的健康果实装箱、运输(采收后2d内)至本单位冷库(0℃)保存备用。

1.1.2 培养基: 试验中所用培养基原材料均购自上海索桥生物技术有限公司,包括马铃薯葡萄糖粉、牛肉膏蛋白胨粉、琼脂粉。试验用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NBA)和牛肉膏蛋白胨(NB)培养液均按照说明进行配置。

1.1.3 供试菌株及其菌饼制备: 本实验涉及菌株包括梨灰霉病病原菌(B. cinerea LHM)、梨青霉病病原菌(P. expansum LQM)和贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) L-1。LHM和LQM由本实验室分离自储藏过程中表现出典型灰霉和青霉病症状的梨果,并经过光学显微镜和致病性验证。病原菌接种PDA培养基,在25℃培养5d,取菌落生长前沿的菌饼(直径6 mm)用于离体和活体活性测定。B. velezensis L-1由作者于2015年9月从梨树根际土壤中分离得到,–20℃保存于20%甘油中。将菌株L-1接种NBA培养基,32℃培养2d,取直径6mm的菌饼用于离体活性测定。菌株L-1已于2017年06月30日提交至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC14373。

1.1.4 菌株L-1发酵液、孢悬液及无菌发酵液制备: 采用摇瓶发酵培养法用200μL菌株L-1孢子(20%甘油–20℃保存)接种100mL的NB培养液,180r/min、32℃培养48h,获得种子液。将种子液按10% (V/V)接种到新的NB培养液中,于180r/min、32℃培养48h,得到发酵液。发酵液经过8000 r/min离心20 min,分别收集沉淀和上清。沉淀用蒸馏水稀释,血球计数板观察调节孢子浓度至108CFU/mL得到孢悬液;上清液经微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤去除孢子,得到无菌发酵液。

1.2 菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的离体活性防效及菌丝生长的影响

平板对峙法测定L-1对梨灰霉病菌的拮抗活性。取灰霉病菌(LHM)菌饼置于PDA平板中央,用无菌打孔器在菌饼两侧3cm处对称打孔,在孔中倒置接种L-1菌饼。接种的平板置于25℃培养。不接种L-1的平皿为对照。每个处理重复3次。待对照菌落长满平板时,测量抑菌圈直径。

参照Wiggins & Kinkel方法测定L-1对青霉菌的拮抗活性。青霉菌(LQM)接种PDA,25℃培养5d,用无菌刀将长有菌落的培养基切成小块,加入50mL蒸馏水,用无菌搅拌器打碎,得到青霉菌孢悬液。将10mL孢悬液加入到500mL 50℃的PDA培养基中,混合均匀后倒平板。在含有青霉菌孢子的平板距平皿边缘20mm的位置对称放置2个牛津杯,每个杯中加入100μL菌株L-1的发酵液,25 ℃恒温培养,测量并记录抑菌圈直径。

挑取上述各处理及对照的梨灰霉菌、青霉菌菌丝,在光学显微镜下观察菌丝和孢子形态,并进行比较。

1.3 菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的活体防效

参考Sadeghian等的方法测定菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的活体防效。将健康新鲜的‘黄冠梨’果实放置于0.2% (V/V)次氯酸钠中浸泡3min,自来水冲洗后晾干。用无菌打孔器在梨果实赤道部两侧各打孔1个,孔径5mm、深3mm。每孔中加入20μL菌株L-1孢悬液(1×108 CFU/mL),以加入20μL蒸馏水作为阴性对照。处理后的果实用保鲜膜封口,20℃保湿培养。培养1d后,在孔内贴置灰霉(LHM)或青霉病菌(LQM)菌饼,置于20℃继续培养,定时(每2d/5d)测定不同处理的病斑直径,并按如下公式计算防效。每个处理重复3次,每个重复6个果。

1.4 菌株L-1耐盐性及其无菌发酵液抗菌作用的稳定性

1.4.1 菌株L-1耐盐性: 将不同量的NaCl加入到NB培养液中,配制成含0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%、12.0%、15%NaCl (W/V)的NB培养液,接种1mL菌株L-1的种子液,180r/min、32℃培养48h,600nm测定OD值。

参照葛平华等、Olfa Kilani-Feki等评估菌株L-1无菌发酵液抗菌作用的稳定性。菌株L-1无菌发酵液经不同处理后(见下文描述),用牛津杯法测定其对梨灰霉病菌的拮抗活性。在PDA平板中央接种灰霉病菌(LHM)菌饼,距培养皿边缘20mm位置处对称放置无菌牛津杯,每杯内加200μL处理的无菌发酵液,测定经不同处理后菌株L-1无菌发酵液的拮抗活性。

1.4.2 酸碱稳定性: 用1mol/L的NaOH或HCl,将菌株L-1无菌发酵液的pH值分别调为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12,静置24h后调回原发酵液pH6.5备用。测定不同酸碱度对其活性的影响。

1.4.3 紫外线稳定性: 将菌株L-1无菌发酵液置于30W紫外灯下,分别照射10、20、30、40、50、60、90、120 min,紫外灯与无菌发酵液垂直,距离为30cm。不经紫外线照射的无菌发酵液为对照,测定紫外线对其活性的影响。

1.4.4 热稳定性: 将菌株L-1无菌发酵液分别在40、50、60、70、80、90、100 ℃金属浴20min后,冷却至室温。未经高温处理的无菌发酵液为对照,测定不同高温处理后其活性的变化。

1.4.5 酶稳定性: 在菌株L-1无菌发酵液中分别加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K,使酶的最终浓度为1mg/mL,37℃反应1h,然后在80℃处理30 min,4℃立即冷却,测定不同蛋白酶处理后菌株L-1无菌发酵液的拮抗活性。

1.5 菌株L-1全基因组测定
 
细菌完整基因组测序与拼接见Sun等。利用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(B518225,生工,上海)提取菌株L-1的总DNA,经过浓度检测后递交北京百迈克公司,利用三代测序平台Pacbio RSII对其进行全基因组测序。通过Prodigal version 2.5软件对编码基因进行预测,借用蛋白质功能数据库COG (Clusters of Orthologous Groups)、GO (Gene Ontolog)、代谢通路数据库KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等功能数据库与该基因组预测的氨基酸序列逐一进行比对,分别对其蛋白质功能和生物学代谢通路进行预测。 
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