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寡核苷酸大规模制备技术存在的问题

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-06-22  浏览次数:78
规模化生产是药物开发的基础,这一点对于反义寡核苷酸药物尤为重要。反义寡核苷酸药物是目前最为成熟的寡核苷酸药物,但由于其没有级联放大作用,在临床和动物实验中使用剂量大,高达25−50 mg/kg[47]或800−1 000 mg/周。因此,作为药物的寡核苷酸必须能够规模化生产,合成克级甚至千克级的寡核苷酸,并要降低成本,才有可能开展临床和动物实验。
 
目前寡核苷酸几乎都是使用化学方法合成,即采用固相亚磷酰胺三酯法合成,并用高效液相色谱分离纯化。常规的DNA合成仪只能合成毫克级的寡核苷酸,大规模DNA合成必须采用克级和千克级DNA合成仪,如GE Healthcare公司生产的 KTA OligoPilot系列。
 
目前仅有少数大型国际生物制药公司,如美国ISIS公司和丹麦的Santaris公司,才有能力合成千克级的寡核苷酸,开展反义药物的大规模临床研究。国内仅有军事医学科学院王升启等开展了寡核苷酸大规模合成及动物实验,但目前尚无核酸药物上市或进入临床实验。究其主要原因,大规模合成寡核苷酸,仪器设备成本过于高昂,一直是寡核苷酸药物研究的瓶颈。
 
另外,化学合成寡核苷酸初产品被杂质和截短的错误序列(又叫失败序列)所污染,使产物纯化十分困难。产生这些失败序列的原因是在合成过程中脱三苯甲基(Detritylation)、耦合(Coupling)、硫化(Sulfurization)或保护(Capping)等反应不完全造成的,因此,必须对寡核苷酸粗产品进行纯化。然而合成寡核苷酸中最难以除去的杂质是大量(n-1)缺失序列(与完整长度为n的寡核苷酸相比仅相差一个核苷酸)。
 
对于长度为18-21碱基对的寡核苷酸,用高效液相色谱法几乎无法从产品中完全除去(n-1)缺失序列。此外,合成过程需要采用多种有害化学试剂,例如去保护试剂——三氯乙酸(TCA)或二氯乙酸(DCA),必须溶解在卤化溶剂中(通常是二氯甲烷)。二氯甲烷具有高毒性、高挥发性和致癌性。因此,大规模的寡核苷酸生产不仅成本高昂,而且涉及到使用和处理危险化学品,对环境和人体存在潜在的威胁。
 
3 核酸扩增技术应用于制备寡核苷酸
 
寡核苷酸在现代分子生物技术和生物制药研究中应用十分广泛。对具有特定序列的目标寡核苷酸进行扩增,不仅是一个需要克服的技术难题,而且在生物医药科学研究中具有重要的应用价值。商业化药物生产需要大量(以千克计)的寡核苷酸。传统的化学合成寡核苷酸不仅成本高昂,而且初产品纯度低、难以纯化,十分不利于临床研究和大规模药物生产。因此,开发一种简单、经济和安全的寡核苷酸大规模工业化生产方法已成为必要,而采用生物技术,用核酸扩增方法制备寡核苷酸无疑是最佳方案。
 
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术自诞生以来,一直是核酸扩增的主要方法。PCR和逆转录PCR技术在用于扩增有足够长度的DNA和RNA时简单而有效。但无法用PCR技术直接扩增短链寡核苷酸和siRNA。因为它们往往只有18-30个核苷酸的长度,无法设计一对特异性PCR引物。用PCR来扩增寡核苷酸或siRNA,首先必须设法将目标延长(如加接头或使用通用引物),如此不可避免地会在产物中引入非目标序列。
 
这在检测分析方法中没有问题,但对于制备方法而言,非常不利于后期分离纯化。而且由于底物是修饰性dNTPs,价格非常昂贵,产物中如果含有非目标序列,会造成底物(dNTPs)的浪费,是难以接受的。另外,更重要的是PCR只是将寡核苷酸引物延伸,PCR扩增产物的分子数不可避免地受输入寡核苷酸引物分子数的限制,因此PCR只能实现DNA分子量增加,而无法使寡核苷酸分子数目增加。因此,PCR技术不适合进行短链寡核苷酸或siRNA的大量制备。
 
近年来,基于核酸扩增技术的检测和诊断方法已获得广泛应用,给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。因此,国内外众多学者不断致力于改进和探索新型核酸扩增技术,已经建立了多种多样的新型核酸扩增方法。按照扩增过程中温度是否变化来划分,核酸扩增方法可分为热循环扩增和恒温扩增两大类。
 
热循环扩增主要包括经典的核酸扩增技术——PCR和连接酶链式反应(Ligase chain reaction, LCR),而恒温扩增主要包括链置换扩增(Strand displacement amplification, SDA)、滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA)、环介导扩增(Loop mediated amplification, LAMP)、依赖解旋酶扩增(Helicase-dependent amplification, HDA)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence based amplification,NASBA),等等。
 
这些DNA扩增技术和PCR一样,都需设计并采用至少一对化学合成的寡核苷酸作为引物,不可避免地会在产物中引入非目标序列。此外,这些方法只是将寡核苷酸引物延伸,其扩增产物的分子数也同样不可避免地受输入寡核苷酸引物浓度的限制,二次扩增必须加入新的寡核苷酸引物。因而一般也都不适合大量制备长度约20个碱基左右的寡核苷酸。
 
目前,已报道的专门用于扩增和制备短寡核苷酸的方法极少。指数扩增反应(EXPAR)是一个极为快速的恒温反应,能够在10 min内快速扩增和制备目标寡核苷酸。EXPAR依赖于切刻内切酶Nt.BstNBI和具有链置换活性的DNA聚合酶,因此又被命名为切刻酶扩增反应(Nicking enzyme amplification reaction, NEAR)。然而,目前EXPAR的应用十分有限,因为据报道该反应存在严重的非特异性扩增。
 
此外,该反应产物是单链的,仅对目标链进行扩增,而其模板(反义链)并未得到扩增。并且,EXPAR反应无法进行二次扩增,产量还是会受输入模板分子数目的限制,因此也不适合大量制备寡核苷酸。另外,滚环复制(Rolling circle replication, RCR)方法已被用于扩增环形DNA,可用于制备寡核苷酸。
 
然而,每轮RCR扩增之前都必须要进行费时费力的人工酶切、连接和重新环化,使之不适合进行自动化的大规模寡核苷酸制备。最近,Ducani等在Nature Method杂志报道改进版的RCR方法,称为Monoclonal stoichiometric (MOSIC)方法。MOSIC方法依赖于具有链置换活性的Phi29 DNA聚合酶,以及特殊的内切酶BseGI,可按照预设的比例产生多个目标序列的单链寡核苷酸,预期可用于DNA纳米材料的制备。但目前该方法尚未实现制备带有修饰基团的药用寡核苷酸。 
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