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肠外致病性大肠杆菌分离培养方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-01-05  浏览次数:264
1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集: 病料采自新疆石河子地区某规模场送检的因呼吸道感染死亡的羊肺脏组织。

1.1.2 主要试剂和仪器及实验动物: 各类培养基购自Oxiod公司;药敏纸片(21种)购自杭州天和微生物试剂有限公司;Taq酶、dNTP Mix、Marker等购自Takara公司。细菌生化鉴定仪(VITEK 2 COMPACT)购自梅里埃生物公司。昆明系小鼠购自石河子大学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 病原微生物的分离培养: 无菌采集病死羔羊肺脏组织,划线接种于绵羊血琼脂平板,37 ℃培养10-15 h,挑取菌落涂片染色镜检,观察菌体形态及染色特性。

1.2.2 生化鉴定: 将分离菌纯培养物在营养琼脂培养基上接种划线,37 ℃培养过夜,按照细菌生化鉴定仪使用说明书进行生化鉴定(47种生化反应)。同时接种伊红美兰和麦康凯培养基观察菌落形态。

1.2.3 细菌基因组的提取和16S rRNA基因序列分析: 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组,根据GenBank公布的大肠杆菌16s rRNA基因(LC217387.1)序列设计引物,序列见表1。以细菌基因组DNA为模板PCR扩增16s rRNA基因序列,PCR反应体系和条件参照文献。PCR反应产物连接pMD18-T载体后送新疆昆泰锐生物技术有限公司测序,测序结果与GenBank数据库基因序列进行相似性比对。

1.2.4 小鼠致病性试验: 普通级成年昆明系小鼠分为试验组和对照组,每组5只。挑取单菌落37 ℃、150 r/min振荡培养过夜,4 ℃、5 000 r/min离心3 min收集菌体,用灭菌PBS悬浮菌体,按0.2 mL/只(6×108 CFU/mL)剂量腹腔注射,对照组注射等量灭菌PBS。观察并记录小鼠状态和死亡情况,剖检死亡小鼠并分离细菌。

1.2.5 药敏试验: 按照CLSI标准采用纸片扩散法,使用常用21种新药敏纸片,包括青霉素、阿莫西林、头孢唑啉、头孢他啶、头孢拉定、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、多西环素、麦迪霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、多粘菌素B、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、复方新诺明、阿奇霉素、米诺环素和克林霉素,以Escherichia coli ATCC 25922作为质控菌株。

1.2.6 分离株毒力因子检测及测序: 根据文献设计并合成papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA和vaT等肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)毒力基因的9对引物,序列见表 1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以细菌基因组为模板对9种毒力因子进行PCR扩增,产物送新疆昆泰锐生物技术有限公司测序。

1.2.7 病理组织学观察: 采集送检病死羔羊和人工感染死亡小鼠的肺脏组织固定,按常规方法制作石蜡切片,HE染色,显微镜观察病理变化。 
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